LABMUN LABORATÓRIO DE MORTE EM UNICELULARES
PROJETOS
Metacaspases são peptidases de eucariotos inferiores similares as caspases que são enzimas que participam do sistema de morte celular em mamíferos. Foram encontrados diversos tipos de metacaspases em plantas, fungos e protozoários, e experimentos de viabilidade celular demonstraram que elas, assim como as caspases em mamíferos, estão intimamente correlacionadas com a morte celular nestes organismos. As análises das estruturas primárias sugerem que as metacaspases possuem sua estrutura terciária similar as caspases. As metacaspases assim como as caspases são expressas na forma de zimogênio inativo. Do ponto de vista da especificidade por substrato as caspases possuem afinidade por resíduos de ácido aspártico na posição P1, além de importantes interações com os resíduos nas posições P2, P3 e P4, de maneira que existem substratos disponíveis capazes de diferenciar as diferentes caspases. Porém, as metacaspases possuem uma especificidade por resíduos de arginina na posição P1 e até o momento existem poucos estudos sobre a especificidade por substrato dessas enzimas.
Em nosso projeto clonamos e produzimos as metacaspases de Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Leishmania amazonensis (LaMCA-Ia), Plasmodium falciparum (PfMCA-Ia), Saccharomyces cerevisiae (ScMCA-Ia) e Candida albicans (CaMCA-Ia) recombinantes em sistema de expressão em Escherichia coli. Realizamos o estudo bioquímicos para a determinação dos parâmetros cinéticos (KM, kcat e kcat/KM), com isso estudamos a especificidade, avaliamos qual o efeito de sais, pH e temperatura na atividade proteolítica destas proteases. É descrito importância do cálcio no funcionamento destas proteases, assim realizamos ensaios cinéticos com as enzimas selvagens e contendo mutações sítio dirigidas, variando a concentração destes íons e averiguarmos qual a importância dele na relação estrutura-atividade destas proteases, avaliando o efeito do cálcio nos parâmetros físico-químicos das metacaspases.
Nome: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE METACASPASES RECOMBINANTES DE PROTOZOÁRIOS DE INTERESSE CLÍNICO
Coordenação: Prof. Dr. MAURICIO FERREIRA MARCONDES MACHADO
Linha de Pesquisa: BIOTECNOLOGIA APLICADA A SAÚDE HUMANA, ANIMAL E AMBIENTAL
Órgãos Financiadores: FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP – CAPES ORGANIZACAO MOGIANA DE EDUCACAO E CULTURA SOCIEDADE SIMPLES LIMITADA – OMEC FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SAO PAULO – FAPESP Resumo:
O presente projeto de pesquisa é continuidade dos projetos anteriores realizado por nosso grupo de pesquisa, nos quais produzimos metacaspases de leveduras em sistema de expressão em E. coli em suas formas selvagens e contendo mutações sítio dirigidas. Interessantemente, as metacaspases de leveduras são classificadas como pertencentes do grupo I, que tem como característica apresentar sua região N-terminal constituída por resíduos apolares, rica em asparaginas, glutaminas e prolinas. A caracterização bioquímica destas enzimas é comprometida devido a insolubilidade delas, sendo necessário produzi-las sem seu N-terminal. Interessantemente, as metacaspases de protozoários, pertencem ao grupo II destas enzimas, que tem a característica de não apresentar a porção apolar em seu N-terminal, sendo solúvel e ativas em sua forma monomérica. Em trabalhos anteriores de nosso grupo já clonamos, realizamos mutações sítio dirigidas e caracterizamos bioquimicamente a metacaspase-2 de T.brucei (TbMCA-IIb). No presente projeto de pesquisa, pretendemos obter as metacaspases recombinantes de Trypanossoma cruzei, Leishmania amazonenses e Plasmodium falciparum, e com essas enzimas recombinantes pretendemos avaliar suas características físico-químicas, avaliando a interação de íons cálcio que são essenciais para a ativação e atividade das metacaspases, realizarmos a caracterização bioquímica completa dessas enzimas como ensaio com substratos sintéticos, estudo do pH e temperatura. Tal caracterização bioquímica será importante para que em futuros experimentos com colaboradores possamos testar e avaliar a ação de moléculas com a capacidade de modular a atividade das mecaspases, sendo de grande interesse para o desenvolvimento de novos fármacos contra essas doenças negligenciadas.
Produções Intelectuais Associadas:
| OXIMIC COMPOUNDS AS POTENTIAL INHIBITORS OF METACASPASE-2 (TBMCA2) OF TRYPANOSOMA BRUCEI | ARTIGO EM PERIÓDICO |