PROJETOS

Metacaspases são peptidases de eucariotos inferiores similares as caspases que são enzimas que participam do sistema de morte celular em mamíferos. Foram encontrados diversos tipos de metacaspases em plantas, fungos e protozoários, e experimentos de viabilidade celular demonstraram que elas, assim como as caspases em mamíferos, estão intimamente correlacionadas com a morte celular nestes organismos. As análises das estruturas primárias sugerem que as metacaspases possuem sua estrutura terciária similar as caspases. As metacaspases assim como as caspases são expressas na forma de zimogênio inativo. Do ponto de vista da especificidade por substrato as caspases possuem afinidade por resíduos de ácido aspártico na posição P1, além de importantes interações com os resíduos nas posições P2, P3 e P4, de maneira que existem substratos disponíveis capazes de diferenciar as diferentes caspases. Porém, as metacaspases possuem uma especificidade por resíduos de arginina na posição P1 e até o momento existem poucos estudos sobre a especificidade por substrato dessas enzimas. Em nosso projeto clonamos e produzimos as metacaspases de Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Leishmania amazonensis (LaMCA-Ia), Plasmodium falciparum (PfMCA-Ia), Saccharomyces cerevisiae (ScMCA-Ia) e Candida albicans (CaMCA-Ia) recombinantes em sistema de expressão em Escherichia coli. Realizamos o estudo bioquímicos para a determinação dos parâmetros cinéticos (KM, kcat e kcat/KM), com isso estudamos a especificidade, avaliamos qual o efeito de sais, pH e temperatura na atividade proteolítica destas proteases. É descrito importância do cálcio no funcionamento destas proteases, assim realizamos ensaios cinéticos com as enzimas selvagens e contendo mutações sítio dirigidas, variando a concentração destes íons e averiguarmos qual a importância dele na relação estrutura-atividade destas proteases, avaliando o efeito do cálcio nos parâmetros físico-químicos das metacaspases.