Laboratório de Morte em Unicelulares

Inserido no CIIB

(Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica)

na UMC, nosso grupo estudo o efeito in vivo e in vitro das Metacaspases, que são enzimas proteolíticas envolvidas na morte celular programada (apoptose) em organismos unicelulares como leveduras, protozoários e fungos. Realizamos clonagem e mutações sítio dirigidas para caracterização química, físico-química e estrutural destas enzimas. Também avaliamos o efeito in vivo da metacaspase de Saccharomyces cerevisiae, através de técnicas de imunofluorescência, citometria de fluxo, entre outras utilizando um modelo nocauteado desta levedura para o gene da metacaspase.

PROJETOS

Metacaspases são peptidases de eucariotos inferiores similares as caspases que são enzimas que participam do sistema de morte celular em mamíferos. Foram encontrados diversos tipos de metacaspases em plantas, fungos e protozoários, e experimentos de viabilidade celular demonstraram que elas, assim como as caspases em mamíferos, estão intimamente correlacionadas com a morte celular nestes organismos. As análises das estruturas primárias sugerem que as metacaspases possuem sua estrutura terciária similar as caspases. As metacaspases assim como as caspases são expressas na forma de zimogênio inativo. Do ponto de vista da especificidade por substrato as caspases possuem afinidade por resíduos de ácido aspártico na posição P1, além de importantes interações com os resíduos nas posições P2, P3 e P4, de maneira que existem substratos disponíveis capazes de diferenciar as diferentes caspases. Porém, as metacaspases possuem uma especificidade por resíduos de arginina na posição P1 e até o momento existem poucos estudos sobre a especificidade por substrato dessas enzimas.

Em nosso projeto clonamos e produzimos as metacaspases de Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Trypanossoma brucei (TbMCA-IIa), Leishmania amazonensis (LaMCA-Ia), Plasmodium falciparum (PfMCA-Ia), Saccharomyces cerevisiae (ScMCA-Ia) e Candida albicans (CaMCA-Ia) recombinantes em sistema de expressão em Escherichia coli. Realizamos o estudo bioquímicos para a determinação dos parâmetros cinéticos (KM, kcat e kcat/KM), com isso estudamos a especificidade, avaliamos qual o efeito de sais, pH e temperatura na atividade proteolítica destas proteases. É descrito importância do cálcio no funcionamento destas proteases, assim realizamos ensaios cinéticos com as enzimas selvagens e contendo mutações sítio dirigidas, variando a concentração destes íons e averiguarmos qual a importância dele na relação estrutura-atividade destas proteases, avaliando o efeito do cálcio nos parâmetros físico-químicos das metacaspases.

Financiamentos

Universal CNPq 2010 – Produção e caracterização das Metacaspases (MCAs): Criando ferramentas para o estudo da morte celular programada em eucariotos inferiores
Universal CNPq 2012 – Estudo da Metacaspase-2 de Trypanossoma brucei contendo mutações sítio-dirigidas: Papel do cálcio na ativação, especificidade e estrutura da TbMCA2
Caracterização bioquímica de caspases-símile envolvidas no ciclo celular de eucariotos simples (FAPESP 2015/11190-0)
Produção de metacaspases de leveduras com truncamento do N-terminal e contendo mutações sítio dirigidas e caracterização bioquímica destas enzimas (FAPESP 2019/05936-0).
Obtenção e caracterização bioquímica de metacaspases recombinantes de protozoários de interesse clínico (FAPESP 2022/06394-0)

ARTIGOS

O foco principal de estudo do LabMUN são enzimas proteolíticas envolvidas na morte celular de organismos eucariotos simples, analisando resíduos chave para o funcionamento destas macromoléculas através de mutações sítio dirigidas. A seguir temos os principais artigos gerados durante os anos onde foram avaliados diversas enzimas e os resíduos chaves para o seu funcionamento.

The role of Tyr⁶⁰⁵ and Ala⁶⁰⁷ of thimet oligopeptidase and Tyr⁶⁰⁶ and Gly⁶⁰⁸ of neurolysin in substrate hydrolysis and inhibitor binding. (doi: 10.1042/BJ20070060),

Catalytic properties of thimet oligopeptidase H600A mutant. (doi: 10.1016/j.bbrc.2010.03.045)

Substrate specificity and the effect of calcium on Trypanosoma brucei metacaspase 2. (doi: 10.1111/febs.12248)

Processing of metacaspase 2 from Trypanosoma brucei (TbMCA2) broadens its substrate specificity. (doi: 10.1016/j.bbapap.2017.01.002)

CPP-Ala-Ala-Tyr-PABA inhibitor analogs with improved selectivity for neurolysin or thimet oligopeptidase. (doi: 10.1016/j.bbrc.2019.11.097)

Classification and Nomenclature of Metacaspases and Paracaspases: No More Confusion with Caspases. (doi: 10.1016/j.molcel.2019.12.020)

Cysteine proteases as potential targets for anti-trypanosomatid drug discovery. (doi: 10.1016/j.bmc.2021.116365)

galeria

Estrutura tridimensional da TbMCA2 representada em verde, enfatizando os dois sítios de autoprocessamento indicados em vermelho (Lys⁵⁵ e Lys²⁶⁸), a região N-terminal em azul bloquenado o sítio ativo da enzima, e a representação da estrutura tridimensional da YCA1 em roxo

Resultado da análise de restrição do clone da CaMCA-WT, após digestão com as enzimas EcoRI e NheI.

Cromatograma da purificação por afinidade em resina de Ni²⁺–sepharose da proteína CaMCA-WT

Análise das amostras eluídas na cromatografia de Ni²⁺–sepharose em eletroforese SDS-PAGE a 15%.

Cinética de Michaelis-Mentem para o mecanismo inibitório da TbMCA2 pelo composto TB-01 e a determinação do K_i

Efeito do composto TB-15 sobre a estrutura da TbMCA-IIa. (A) efeito do TB-15 na estrutura da TbMCA-IIa selvagem, onde (·) sem composto, (o) com 2 mM de TB-15 e () com 10 mM de TB-15; (B) efeito do TB-15 osobre a estrutura do mutante de sítio de cálcio TbMCA2 D189/190A, onde (·) sem composto, (o) com 2 mM de TB-15 e () com 10 mM de TB-15 e (C) Dissociação do TB-15 com a TbMCA2 selvagem.

Comparação por citometria de fluxo da taxa de sobrevivência das células tratadas com H₂O₂ (0, 0,5, 1 e 2mM respectivamente): (A) Selvagem; (B) Nocaute; (C) Representação gráfica da porcentagem de sobrevivência em H₂O_2.